БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТРАНСФЕР-ФАКТОРА
Цыбиков Н.Н.,Кузник Б.И., Арьяева М.М.
Читинская государственная медицинская академия
К настоящему времени накопилось достаточно много сведений о положительном клиническом эффекте применения продуктов линии 4LifeТрансфер Факторов® (ТФ). Так, эффективность этого препаратов выявлена при лечении детских инфекционных заболеваний [3], вирусных гепатитах [6], риноситуситах [5], аутоиммунных заболеваниях [24], бронхиальной астме [1], сахарном диабете [2]. и др. Такая полифункциональность трансфер- факторов(тф) не может не вызывать удивления и требует объяснений. Действительно, почему пептид из молозива коров или желтка яиц способен не только нормализовать иммунитет, но и проявлять, безусловно, лечебные свойства при различных заболеваниях? Можно ли сегодня трансфер- факторы называть биологически активными добавками, или же это лекарственные препараты? Оправдан ли тот оптимизм, которым «дышит» каждая научная статья, посвященная трансфер-фактору? На все обозначенные вопросы мы постараемся ответить в этой статье с позиций нашего 40-летнего опыта работы с другими пептидными иммуномодуляторами, близкими по структуре и биологическим свойствам трансфер-фактору (Кузник и др., 1989, 1997, 2003, 2008, 2010, Цыбиков).
Молозиво теплокровных животных или желток птиц является первым нутриентом и природа не могла не заложить в эти продукты филогенетический и онтогенетический опыт борьбы с громадным разнообразием внешних и внутренних патогенов, способных нарушить гомеостаз организма. Поэтому в филогенезе иммунная система создавалась, в первую очередь, как система, сохраняющая гомеостаз и во вторую – для борьбы с доминирующими патогенами внешней среды – микроорганизмами [19]. Наиболее емкими структурами, способными воспринять резистивные свойства молозива или желтка, являются пептиды. Последние выступают в качестве лигандов рецепторов громадного количества клеток, реализующих механизмы как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Представить себе в качестве носителя фило- и онтогенетической информации белок, в том числе IgM или sIgA, сложно. Эти иммуноглобулины способны повышать резистентность слизистых оболочек, однако не резорбируются в желудочно-кишечном тракте, и, следовательно, не способны оказать генерализованный стимулирующий эффект на иммунитет.
Поскольку трансфер- фактор принимается per os часто возникает вопрос всасываются ли не всасываются пептиды (полипептиды) в кишечнике. Общепринято, что ди –и трипептиды легко резорбируются энтероцитами. Однако, трансфер-фактор по сути полипептид ( 44 аминокислотных остатка) и возможность его всасывания исключается. Тогда как же этот препарат оказывает местный и генерализованный иммуномодулирующий эффект? Нам представляется очевидным, что при пассаже через тонкий кишечник трансфер -фактор подвергается пептидолизу и его различные фрагменты, начиная от нативной молекулы до дипептидов, оказывают стимулирующий или регулирующий эффект на различные субпопуляции лимфоцитов слизи кишечника. Более того, в тонком кишечнике лимфоидные фолликулы, содержащие все разновидности лимфоцитов и фолликулоассоциированный эпителий, реагируют через рецепторы на различные фрагменты трансфер -фактора, обеспечивая его полипрофильный эффект. Не исключено, что в процессе резорбции трансфер -фактора и его фрагментов принимают участие М-клетки слизистой кишечника. М-клетки – типичные эпителиальные клетки, в которых выделяют два основных домена апикальной и базолатеральной мембраны. Характерным является то, что в базолатеральной части присутствует субдомен, который умножает клеточную поверхность и образует внутриэпителиальные карманы, в которых находятся практически все разновидности лимфоцитов. Апикальная мембрана М-клетки не содержит микроворсинок, что облегчает поступление трансфер- фактора и его фрагментов в цитоплазму М-клетки и в дальнейшем во внутриэпитеальальные карманы. Здесь происходит активация/супрессия лимфоцитов, в дальнейшем они мигрируют в другие лимфоидные образования организма и обеспечивают генерализованный иммунный ответ. Ожидаемо, что часть лимфоцитов подвергается хомингу и, возвращаясь во внутриэпителиальные карманы, усиливают местный иммунитет, в основном, через гиперпродукцию sIgA.
Вместе с тем, большинство пептидов являются не просто иммуностимуляторами, а оказывают иммуномодулирующий эффект: в случае иммунодефицита они повышают иммунный потенциал, а при излишней активации – тормозят иммунные реакции. В этом уникальность иммунноактивных пептидов, в том числе и трансфер- фактора. Так, достаточно точно показано, что иммунодефициты, вызванные неонатальной тимэктомией (удаление тимуса сразу после рождения ), бурсаэктомией in ovo (удаление сумки Фабрициуса у зародыша птиц), радиооблучением, иммунодепрессантами, ожогами, отморожениями, канцерогенезом, инфекциями и тд., ликвидируются при инъекциях пептидных препаратов: тимарина, тимогена, тималина, авистимулина, эпиталямина [8,9,10]. Эти же препараты оказываются эффективными при лечении иммунопатологии в клинике. Так, показано [9,10,18,22], что при заболеваниях, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами (ожоги, отморожения, деструктивные поражения лёгких, эндокардиты, инфекционные заболевания взрослых и детей, хирургической инфекции и даже злокачественные образования) назначение пептидных препаратов оказывает выраженный терапевтический эффект [18, 14, 11, 8, 22]. Отсюда невольно возникает вопрос, каким образом пептиды, в том числе и трансфер- фактор, способны ликвидировать иммунопатологические состояния? Как клетка-мишень, в нашем случае иммунокомпетентная клетка, "узнает" и каким образом реагирует на иммуноактивные пептиды? Для ответа на эти вопросы был проведен больший цикл исследований в различных лабораториях мира. Во второй половине ХХ века достаточно четко было установлено, что все биологически активные вещества, в том числе пептидной и белковой природы, оказывают свое воздействие на клетки-мишени через специфические образования цитоплазматических мембран - рецепторы. Для большинства пептидных регуляторов (нейропептидов, гормонов желудочно-кишечного тракта, биологически активных соединений сердечно-сосудистой и дыхательной систем) рецепторы были выделены и изучены их химическая природа и функции. На первых этапах наших исследований было установлено, что иммунорегуляторные пептиды способны изменять экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах. Уже эти факты предполагают наличие лиганд-рецепторных отношений между субстратом и пептидами. В различных тестах неиммунного розеткообразования получены результаты, свидетельствующие о возможном пептид-рецепторных взаимоотношениях [10, 22]. Наиболее исчерпывающие данные относительно рецепторов к пептидам были установлены в нашей лаборатории [9,10,20,22]. Так, методом дифференциального ультрацентрифугирования был выделен интегральный белок цитоплазматических мембран, затем посредством аффинной хроматографии получили белок, способный связываться с пептидами, в последующем с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии отпрепарирован рецепторный белок с молекулярной массой 122 кД. Антитела к полученному белку блокировали пептид-рецепторные взаимоотношения на культивируемых клетках-мишенях. Несколько позже в различных исследованиях обнаружены рецепторы к иммуноактивным пептидам на органоидах клеток: мембранах ядер, митохондрий, лизосомах, микросомах [12, 20, 27]. Действуя на рецепторы клеточной мембраны, а также на рецепторный аппарат органелл, иммуноактивные пептиды способны вызывать разнонаправленные ответные реакции и в целом регулировать гомеостаз, в том числе и в системе иммунитета. Здесь уместно подчеркнуть, что рецепторы к пептидам, в том числе и трансфер- фактору, вероятно располагаются не только на иммунокомпетентных, но и других клетках организма. В противном случае сложно объяснить "неиммунные" эффекты трансфер- фактора, например, его моментальные психомодулирующие ответы. (Рецепторы есть на нервных клетках - синтез и секреция эндорфинов, серотонина). Возможность прямого воздействия иммунорегуляторных пептидов на кору и подкорковые образования центральной нервной системы описаны ранее (Дильман, Ашмарин). В экспериментах на животных, получавших трансфер- фактор, значительно ускоряются реакции избегания и значительно улучшается память , а у человека также уменьшается время фиксации информации в долговременной памяти и значительно уменьшается утомляемость внимания [21]. Трансфер-фактор способен легко проникать через гематоэнцефалический барьер и воздействовать на нейроны, и такие взаимодействия могут носить как рецепторный, так и нерецепторный характер. Известно, что иммуноактивные пептиды, обладающие нейромодулирующим влиянием, регулируют активность ферментов синаптического звена путем прямого взаимодействия лиганда с макромолекулой фермента. Кроме того, пептиды изменяют проницаемость мембраны, непосредственно влияя на молекулы ионных каналов, или образуя ионный канал при внедрении пептида в липидный матрикс, что сопровождается модулирующей реакцией нейронов. Наконец, мишенью действия пептида может быть молекула нейротрансмиттера, с которой регуляторный пептид образует комплекс, что ведет к изменению реакций постсинаптической клетки [27].
Основное назначение пептидов сводится к выполнению своих специфических функций на уровне межклеточных взаимодействий и осуществлению связи между нейрогуморальной регуляцией и геномом. Установлено, что они способны изменять функциональную активность генома [18]. Действие пептидов на процессы дифференцировки клеток происходит в фазу G1 клеточного цикла и сопряжено с увеличением концентрации цАМФ. Влияние же на пролиферацию клеток осуществляется в фазе G2 и также связано с повышением уровня цАМФ и активности фосфодиэстеразы, что сопровождается экспрессией специфических для данной популяции клеток рецепторов [8,10,14]. Действие цитомединов на деятельность клеток может также осуществляться через цГМФ.
Последующие этапы влияния пептидов включают в себя повышение интенсивности синтеза белка, переход метаболизма клетки на качественно новый уровень, характеризующий определенную стадию её дифференцировки. Транслокация пептидов в клетку обусловлена их взаимодействием с селективными мембранными рецепторами. Дальнейшая их функция сводится к созданию оптимальных условий для деятельности клетки.
Однако, это лишь схема, объясняющая биологическую активность пептидов. Согласно современным представлениям, между формированием сотен высокоспецифичных комплексов “первичный посредник - рецептор” и ответной реакцией клетки, которая может выражаться в образовании огромного числа биологических эффектов, выступает около десятка “вторичных посредников”. Кроме цАМФ и цГМФ, наиболее изучены из них ионы кальция, диацилглицерин, инозитолтрифосфат. Можно предполагать, что ионы кальция, как вторичные посредники, должны играть важную роль при действии пептидов из гладких и поперечнополосатых мышц, сердца, сосудов, мочевого пузыря, тромбоцитов и других органов, тканей и клеток. В частности, установлено, что пептиды способны активировать ферментную систему кальциевого насоса - Са-АТФазу и резко снижать (на 50%) ингибирующее действие вандата натрия на деятельность этого фермента [4,9].
Значительный интерес представляют исследования, в которых показано, что отдельные пептиды могут регулировать активность кальмодулина, стимулирующего деятельность таких важнейших ферментов, как аденилатциклаза, фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, Са, Мg-АТФаза, Са- зависимая протеинкиназа, тирозингидроксилаза и триптофангидроксилаза. С другой стороны, существуют полипептиды (к ним относится вещество Р, АКТГ и его фрагменты, поли-L-аргинин, поли-L-лизин и другие), которые могут вызывать конформационные изменения в молекуле кальмодулина и тем самым подавлять действие этого белка на перечисленные ферменты [14,27]. Не исключено, что подобными же свойствами обладают и различные классы трансфер факторов.
В качестве вторичных мессенджеров способно выступать семейство гуанин-нуклеотидсвязывающих белков (G-белков), передающих сигнал с рецепторов мембран на определенные эффекторные молекулы в клетке. В настоящее время установлено, что 80% всех известных нейротрансмиттеров и нейромодуляторов взаимодействуют со специфическими рецепторами (число их, вероятно, достигает 100 и даже 150), которые связаны с эффекторами через G-белки. Доказано, что рецепторы некоторых регуляторных пептидов, в том числе эндотелинов (не путать с эндотелиином) и сарофотоксинов также связаны с эффекторами через G-белки [9,22].
Установлено, что некоторые низкомолекулярные пептиды способны оказывать защитное и потенциирующее действие на функции сердца в условиях токсического стресса, вызванного введением строфантина А. Обнаруженный эффект объяснен снятием ингибирующего действия с мембранного фермента Na+, K+-АТФазы, обеспечивающей гидролиз АТФ, сопряженный с активным переносом ионов через мембрану. Все это приводит к изменению ионного транспорта Na+ и К+, связыванию воды и уменьшению внутриклеточной концентрации ионов Са, которые, как известно, активируют сокращение актомиозина и в условиях токсического стресса вызывают систолическую контрактуру сердечной мышцы [27]. Не исключено, что трансфер- фактор, способен оказывать влияние на деятельность сердца подобно другим “коротким” пептидам.
Но существуют и иные механизмы воздействия пептидов на активность Nа+-K+-АТФазы. В частности, показано, что некоторые гормоны, в том числе и пептидной природы, в опытах in vitro при инкубации с фракцией плазматических мембран гепатоцитов не изменяют активность этого фермента. Будучи же введенными в организм, они значительно стимулируют деятельность Nа+-К+-АТФазы, что объяснено образованием в цитозоле в процессе синтеза белка посредника, названного инвертером. Получены первые экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу [10]. Дальнейшие исследования позволят ответить на вопрос, обладают ли подобным действием некоторые из цитомединов.
Реакция трансфер- факторов может осуществляться и через третичные мессенджеры [7]. Среди нейроспецифических белков особо пристальное внимание за последние годы привлекает протоонкоген, кодирующий фосфопротеин рр55с-fos (пептид М), локализация которого в клетке ограничивается преимущественно ядром. Транспорт этого белка, кодируемого геном с-fos (Fos), из цитоплазмы, где он синтезируется, в ядро контролируется внеклеточными сигналами. Белок Fos обнаружен во многих образованиях центральной нервной системы. Установлено, что ген c-fos и кодируемый им белок участвуют в разнообразных процессах, включая пролиферацию и дифференцировку клеток, а также обеспечивают нейрональную пластичность.
Высказано предположение, что ген с-fos вместе с другими “немедленными ранними генами” выполняет роль третичного мессенджера в механизмах сигнальной трансдукции, приводя к длительным сдвигам метаболические процессы в клетке, ( в частности, увеличение концентрации мРНК белка Fos), что может лежать в основе обучения и долговременной памяти. Напомним, кстати, что многие пептиды, в том числе тималин, эпиталамин, гемалин, вазолин, полипептиды из кишечника, лимфатических узлов и трансфер-факторы) значительно ускоряют процессы обучения и способствуют формированию долговременной памяти [9,21,26]. Не исключено, что в указанных случаях реакция цитомединов осуществляется через третичный посредник “немедленных ранних генов”.
Интимные механизмы действия трансфер- факторов в значительной степени могут быть объяснены с позиций открытия, сделанного в последнее десятилетие. Речь идет о способности нейронов мозга в присутствии L-аргинина (метаболизируемая форма аргинина) синтезировать и выделять оксид азота , играющего роль модулятора синаптической передачи, обучения и памяти. Предполагается, что при развитии длительной потенциации окись азота выполняет функцию ретроградного клеточного сигнала, который возникает в постсинаптическом нейроне и распространяется к пресинаптическим нервным окончаниям, увеличивая секрецию нейромедиаторов. В гипоталамусе оксид азота способен оказывать влияние на секрецию либеринов и, в частности, кортиколиберина - 41. С одной стороны, NО играет роль молекулы посредника, а с другой – в больших дозах проявляет цитотоксическое действие. В частности, с этим свободнорадикальным соединением, обладающим высокой реакционной способностью, связывают токсическое влияние макрофагов на опухолевые клетки, бактерии и грибки, которое предотвращается ингибиторами NO-синтазы (NOS) - фермента, катализирующего продукцию оксида азота. Установлено, что существует 2 изоформы NOS, отличающиеся по структуре и способу регуляции. Конститутивная NO-синтаза (с-NOS) постоянно присутствует в клетках. Её активность находится в прямой зависимости от уровня ионов Са и опосредуется через кофактор этого фермента - кальмодулин. Другая изоформа NOS (i-NOS) индуцируется в макрофагах, гладких мышцах, гепатоцитах, нейтрофилах и иных клетках под действием эндо- и экзотоксинов и цитокининов и продуцирует большое количество NO в течение длительного времени. Последняя же вовлекается в большое число реакций, включая расслабление гладких мышц (кстати, релаксирующее действие ацетил-холина на кровеносные сосуды также обусловлено продукцией NO, которая, оказывая влияние на гладкомышечные клетки, приводит к образованию в них цГМФ), регуляцию иммунного ответа, торможение процесса свертывания крови и агрегации тромбоцитов (кровяные пластинки в большом количестве продуцируют оксид азота), нейротрансмиссию, воздействие на кишечную и микрососудистую проницаемость [16].
Таким образом, есть все основания полагать, что положительные эффекты трансфер- фактора при гипертензии, диабете, атеросклерозе и вазоспазмах различной этиологии реализуются гиперпродукцией оксида азота.
Иммунорегулирующие и, следовательно, гомеостатические эффекты трансфер фактора могут осуществляться и через другие механизмы, и , в первую очередь реализуемые совокупностью естественных аутоантител (аАТ) разной специфичности, формирующие специфический "образ" молекулярного состава организма. Это совокупную систему аАТ профессор А.Б.Полетаев (2008) назвал "Иммункулус". Иммунункулус отражает текущее функционально-метаболическое состояние организма в виде количественного изменения продукции и содержания определенных аАт. Здесь уместно подчеркнуть, что, в отличие от традиционных представлений, аАТ выступают не в качестве инициаторов аутоиммунной патологии, а белками, способными регулировать гомеостаз. В усеченном варианте такие представления о роли иммунной системы нами представлялись ранее (монография Кузник,Цыбиков,1989 ). Трансфер -фактор способен регулировать физиологический уровень аАТ к различным антигенам и, в первую очередь, к ферментам системы гемостаза. Еще в 1984 г. нами были обнаружены аАТ к тромбину и Ха фактору свертывания крови [20], а затем выделены в чистом виде [7,9,22] и доказана их антикоагулянтная активность. В экспериментах было показано, что при тромбозе уровень аутоантител снижается, что и приводит к фибринообразованию. В клинических наблюдениях установлено, что предтромботические и тромботические состояния сопровождаются обязательным снижением уровня аАТ. Вместе с тем, использование иммуноактивных пептидов сопровождается нормализацией содержания аАТ и профилактикой тромботических состояний [7]. Позже "физиологические" аАТ были описаны к гормонам, нейропептидам, компонентам комплемента, антигенам различных систем (нервной, сердечно-сосудистой, пищеварительной, мочевыделительной и др.) и даже созданы тест-системы (Эли-тесты), позволяющие регистрировать физиологическую и патологическую мозаику аАТ (Полетаев 1999). Нами показано, что при сахарном диабете 2 типа назначение трансфер фактора сопровождается обязательной нормализацией уровня аАТ к различным антигенам сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, мочевыделительной, нервной, эндокриной систем организма [2]. Следует особо подчеркнуть, что при месячном курсе трансфер фактора резко снижается концентрация аАТ к антигенам бета-клеток и инсулину [2].
При гнойных риносинуситах местное использование трансфер фактора сопровождается повышением фагоцитарной активности нейрофилов назального секрета и абортивным течением заболевания по сравнению со стандартной терапией [5]. Следует указать, что местное назначение трансфер фактора при патологии ЛОР-органов вызывает активацию моноцитов и интенсивную секрецией их них тканевого прокоагулянта. Последняя реакция не может не сопровождаться повышением местной резистентности [5].
Вероятно, трансфер факторы включают и другой фундаментальный механизм повышения резистентности организма, а именно гиперпродукцию белков теплового шока ( HSP). К такому выводу можно прийти на основании анализа современной литературы и собственных исследований. После действия на клетки повреждающих агентов происходит не только активация синтеза HSP, но и их перемещение внутри клетки. При стрессе HSP накапливаются в наиболее уязвимых участках клетки: в первые 4–5 часов – в ядре, затем в перинуклеарной, присарколеммальной зонах и вдоль актиновых филаментов [25].
Смысл накопления HSP в ядре после повреждения клетки заключается в защите генетического материала, в ограничении деградации прерибосом, восстановлении структуры и функции ядрышек, экранировании нуклеозодоступных участков ДНК [23]. Находясь внутриклеточно, HSP являются частью петли обратной связи с ядерным фактором NF-kB и тем самым ограничивают интенсивность стрессорного воздействия (в том числе острого воспаления) и, следовательно, органных дисфункций. Таким образом, HSP играют значительную роль в повышении устойчивости клеточного аппарата биосинтеза белка к повреждающим воздействиям.
Согласно общепринятой классификации, все HSP распределяются на 6 семейств в соответствии с их молекулярной массой, выраженной в килодальтонах. При этом белки теплового шока, имеющие ММ до 40 кДа, объединяются в так называемые малые HSP (small HSP – sHSP). Остальные представлены семействами HSP70, HSP80, HSP90, HSP100, HSP110 кДа и выше. Представители каждого из семейств выполняют строго возложенные на них функции. Но особое внимание из-за более высокой насыщенности тканей стрессированного организма привлекают HSP с молекулярной массой 70 кДа. Эти белки в настоящее время наиболее хорошо изучены, и установлена их роль в деятельности органов и тканей. Оказалось, что HSP70 является ведущим белком, выполняющим функцию молекулярных шаперонов. Последние участвуют в утилизации и в восстановлении повреждённых белков, то есть несут функцию белков-скрепок, иначе называемую фолдингом (от английского слова fold – складывать, сгибать).
При гнойном аппендиците и осложненном парапроктите введение в комплекс стандартной терапии тималина и трансфер фактора сопровождается снижением уровня антител к HSP-70, что сопровождается замедлением скорости элиминации этого белка теплового шока, а следовательно, повышением резистентности организма [9,13].
Одной из гипотез, объясняющих наступление смерти, является повреждение клетки свободными радикалами, накапливающимися в течение жизни и приводящими к структурным изменениям цитоплазмы. В старости несостоятельность шаперонной функции HSP приводит к гибели клеток и постепенной смерти организма. На самых различных живых объектах (дрозофилы, нематоды, дафнии, мыши, крысы и другие) показано, что шаперонная функция HSP с возрастом значительно снижается [12,13,15]. Если высказанная гипотеза верна, то усиление шаперонной функции HSP должно способствовать продлению жизни. В частности, показано, что инсерционная мутация в гене митохондриального белка Hsp22 приводит к снижению средней продолжительности жизни дрозофилы на 40%. Напротив, сверхэкспрессия Hsp22 в мотонейронах ведет к удлинению срока жизни на 32%, увеличению устойчивости к окислительным повреждениям на 35% и к тепловому стрессу – на 39%. Кратковременное повышение температуры у дрозофил также приводит к накоплению HSP70 и ведёт к увеличению срока их жизни [25]. В опытах на нематодах (Caenorhabditis elegans) установлено, что мутация единственного гена, способствующего возникновению толерантности к действию температуры, продлевает жизнь животных [23]. Кратковременный тепловой шок приводит к увеличению продолжительности жизни животных, то есть оказывает стимулирующее, закаливающее действие (так называемый гормезис). Наконец, ограничение питания у грызунов уменьшает накопление кислых радикалов (ослабляет процессы перекисного окисления липидов – ПОЛ), что ведёт к усилению функции шаперонов и увеличению продолжительности жизни [17].
Важная роль принадлежит HSP70 в иммунном ответе, ибо под его воздействием усиливается синтез провоспалительных цитокинов, в том числе IL-1, TNFa и других, способствующих усилению агрегации тромбоцитов, ускорению свёртывания крови и ингибиции фибринолиза [7, 8, 9, 11], что отмечается при ДВС [7, 9, 22]. Под влиянием патогенных возбудителей из микроорганизмов или зон аутологичного воспаления (повреждённая ткань) высвобождаемые HSP могут узнаваться поверхностными рецепторами иммунной системы – TLR-2, TLR-4, CD14, CD91, CD94, LOX-1 и др. При этом экстрацеллюлярные HSP индуцируют ядерный фактор NF-kB, благодаря чему происходит передача информации о наличии в организме патологического процесса и вовлечение иммунной системы в защитную реакцию, сопровождаемую экспрессией провоспалительных цитокинов [22]. Не подлежит сомнению, что от состояния иммунной системы не только зависят процессы регенерации, но и продолжительность жизни человека.
В настоящее время не подлежит сомнению, что в патогенезе развития атеросклероза одно из ведущих мест принадлежит шаперонам и, в частности, HSP60/65. Установлено, что более 70% больных атеросклерозом имеют анти-HSP-антитела [8]. Последние следует рассматривать как защитный фактор, направленный на элиминацию HSP. Так месячный курс трансфер фактора по данным Эли-теста у пожилых людей сопровождается повышением уровня аАТ к HSP-70 и, что особенно важно, снижением концентрации эндотелеина 1 - основного маркера эндотелиальной дисфункции [2]. В специальных исследованиях нами путем аффинной и высоэффективной жидкостной хроматографии выделены аАТ-абзимы к эндотелеину 1. Функция абзимов заключается в протеазной деградации эндотелеина 1 и следовательно уменьшения степени дисфункции эндотелия. При приеме трансфер фактора уровень аАТ-абзимов к эндотелеину 1 возрастает, что не может не найти отражения в позитивных сдвигах микро- и макроциркуляции [7, 22].
Но каков же механизм геропротекторного действия коротких пептидов? Ответ на этот вопрос дают многочисленные исследования, проведенные В.Х. Хавинсоном и сотр.[27], Б.И. Кузником и сотр. [7], Н.Н. Цыбиковым [22] и многими другими.
Установлено, что пептиды стимулируют процессы клеточной дифференцировки и пролиферации и снижают уровень апоптоза, повышающегося при старении. Установлено, что короткие пептиды стимулируют дифференцировку CD34+ стволовых клеток костного мозга эмбриона человека в CD14+ клетки (миелоциты), CD3+ клетки (предшественники Т-лимфоцитов), CD4+ клетки (Т-хелперы) и CD8+ клетки (цитотоксические Т-лимфоциты). Пептид Lys-Glu-Asp усиливает дифференцировку CD4+CD8+ тимоцитов в Т-хелперы [27]. Таким образом, короткие пептиды способствуют поэтапной дифференцировке клеток лимфоидного ряда, стимулируя переход стволовых форм в малодифференцированные, которые, в свою очередь, под влиянием пептидов переходят в следующую стадию дифференцировки – зрелые клетки. В культуре полипотентных клеток Xenopus laevis установлена дифференцировка их в различные ткани в зависимости от структуры воздействующего пептида [27]. Пептид Ala-Glu-Asp-Gly стимулировал появление нервной ткани, пептид Lys-Glu-Asp-Pro – эпидермиса, мезенхимы и сомитов, пептид Lys(Н-Glu-OH) – сетчатки. Кроме того, пептиды Ala-Glu-Asp-Gly, Lys-Glu-Asp-Pro и Lys(Н-Glu-OH) способствовали усилению синтеза в культуре Xenopus laevis белка α-актина, участвующего в ремоделировании цитоскелета при клеточной дифференцировке. Пептид Ala-Glu-Asp-Gly в 6-8 раз усиливал экспрессию транскрипционного фактора CGRP и белков матричных металлопротеаз – ММР2 и ММР9 в культуре клеток эпифиза крыс, что свидетельствует о стимуляции дифференцировки пинеалоцитов, которая снижается при старении [26]. В старой культуре клеток поджелудочной железы эмбриона человека пептид Lys-Glu-Asp-Trp восстанавливал экспрессию транскрипционного фактора CXCL12 до уровня молодой культуры, что указывает на геноспецифическую дифференцировку исследуемых клеток.
Пептиды стимулировали пролиферацию клеток иммунной, нервной тканей и стволовых клеток. Так, в культуре мезенхимальных стволовых клеток человека под действием пептида Lys-Glu-Asp на 3 и 5 сутки их число в 2 раза превышало контрольный уровень. Пептиды Lys-Glu и Lys-Glu-Asp в органотипической культуре селезенки старых крыс усиливали пролиферативную активность CD8+клеток в 8-10 раз и CD4+ клеток в 2-4 раза. Сходный эффект наблюдался в органотипической культуре тимуса старых крыс. В диссоциированной культуре тимоцитов крыс пептид Lys(Н-Glu-OH) увеличивал число пролиферирующих клеток на 15% при одновременном снижении уровня апоптоза [27].
Исследование влияния коротких пептидов на экспрессию маркёра пролиферации Ki-67 в органотипической культуре клеток эпифиза крыс показало, что под действием пептидов Lys-Glu-Asp и Ala-Glu-Asp-Gly пролиферативная активность клеток возрастает соответственно в 1,7 и 3 раза.
Короткие пептиды в культуре клеток эпифиза и тимуса способствовали снижению уровня экспрессии проапоптотического маркёра р53, уровень которого возрастал при старении [26]. Так, в культуре клеток эпифиза и тимуса старых крыс при введении пептидов Lys-Glu-Asp и Ala-Glu-Asp-Gly, Lys(Н-Glu-OH) и Lys-Glu-Asp экспрессия белка р53 снижалась в 4-8 раз относительно контроля, что свидетельствует об их способности ингибировать развитие программированной клеточной гибели по митохондриальному пути.
С представленных позиций становится ясным один из механизмов геропротекторного действия регуляторных пептидов. Усиливая экспрессию гена HSP70, регуляторные пептиды тем самым способствуют сохранению структуры клетки, увеличивают её устойчивость к стрессам, усиливают процессы роста и дифференцировки, способствуют пролиферативной активности и препятствуют её апоптозу, что в итоге способствует увеличению продолжительности жизни.
В многочисленных исследованиях Хавинсона и соавт. [27] показано, что одним из свойств регуляторных пептидов является значительное торможение процессов ПОЛ и усиление антиоксидантной защиты. В то же время по мере старения организма в самых различных клетках и тканях повышается интенсивность липидпероксидации и ослабляются антиоксидантные функции [26].
В исследованиях на мутантной линии дрозофил, подверженных ускоренному старению вследствие высокого уровня ПОЛ, сравнивалось действие пептидного экстракта эпифиза – эпиталамина и прямого антиоксидантного фермента мелатонина. Установлено, что эпиталамин способствовал снижению уровня продуктов ПОЛ у дрозофил в 2 – 3,4 раза и повышал активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, что сопоставимо с результатами, полученными для эпиталамина. Кроме того, эпиталамин повышал активность супероксиддисмутазы в крови у крыс на 20%, тогда как мелатонин не оказывал такого эффекта. Следует отметить, что синтетический пептид Ala-Glu-Asp-Gly, созданный на основе эпиталамина, также проявлял антиоксидантную активность, что выражалось в снижении образования активных форм кислорода в головном мозге крыс [26, 27].
Не исключено, что действие пептидов, в том числе трансфер- фактора, направленное на нормализацию процессов ПОЛ и усиление антиоксидантной защиты, в значительной степени обусловлено усилением экспрессии гена HSP70 и других шаперонов, являющихся регуляторами процессов липопероксидации и тем самым предотвращающими гибель клетки и, следовательно, развития гиперкоагуляции [7, 9], значительно усиленной в пожилом и старческом возрасте [22, 26].
Одной из теорий, объясняющих механизмы старения, является несостоятельность клеточного и гуморального иммунитета. Известно, что к старости наступает инволюция тимуса. Большая часть его долек замещается жировой тканью. Регуляторные пептиды, приводящие к увеличению концентрации HSP, восстанавливают клеточность и функциональную активность вилочковой железы [26, 27].
Известно, что при старении усиливается агрегационная активность тромбоцитов, ускоряется свёртываемость крови и тормозится фибринолиз, благодаря чему значительно усиливается постоянное внутрисосудистое свёртывание крови [7]. Вместе с тем, многочисленными исследованиями показано, что пептиды при стрессорных воздействиях и при различных патологических состояниях нормализуют состояние системы гемостаза [7, 26, 27]. Не исключено, что это свойство пептидов способствует в пожилом возрасте снижению частоты развития тромбоэмболических заболеваний, и, следовательно, приводит к увеличению срока продолжительности жизни [27].
Установлено, что многие пептиды способствуют увеличению численности основных популяций клеток тимуса в стареющих (8 пассажей) культурах, что выражалось в снижении численности незрелых CD4+CD8+ клеток и увеличении числа зрелых CD4+ и CD8+ клеток. Другим признаком усиления дифференцировки тимоцитов под действием пептидов служило повышение доли активированных тимоцитов, экспрессирующих CD3. Кроме того, было установлено, что ряд пептидов способны усиливать пролиферативную активность тимоцитов [14]. Не исключено, что такими же свойствами обладает и трансфер фактор.
В исследовании В.О. Поляковой и др. [13] было выявлено геропротекторное действие пептида Lys(Н-Glu-OH) на эпителиальные клетки тимуса (ТЭК) в стареющей культуре, прошедшей 8 пассажей [14]. Число вступивших в апоптоз ТЭК в контрольной культуре составляло 20-25%, тогда как под действием пептида оно снижалось до 10-14%. Стимулирующее действие пептида Lys-Glu на культуру клеток тимуса выражалось не только в активации клеточного звена вилочковой железы, но и в усилении синтетической функции тимуса. Показано, что пептид Lys-Glu стимулирует синтетическую активность эпителиальных клеток тимуса в отношении IL-1β и IL-7 [14]. Возможно, данный дипептид выступает в роли физиологического стимулятора выработки IL-1β и IL-7, которые, в свою очередь, оказывают регуляторные эффекты на процессы дифференцировки и пролиферации тимоцитов [14].
Таким образом, применение пептидов способствует восстановлению большинства показателей, характеризующих функциональную активность тимуса при старении, что также свидетельствует о возможности пептидной коррекции возрастной инволюции тимуса, ключевым звеном которой, вполне вероятно, является активация экспрессии белков теплового шока. В то же время восстановление функции тимуса при старении, а также при развитии вторичных иммунодефицитов сопровождается нормализацией сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свёртывания крови и фибринолиза [7, 22].
В настоящее время установлено, что шапероны являются переносчиками пептидов, образуемых самыми различными клетками. Более того, HSP-ассоциированные пептиды служат антигенными отпечатками клеток или тканей, из которых они выделены [15]. Если это так, то нет ничего удивительного в том, что они вступают во взаимодействие с рецепторными участками ДНК и непосредственно с белками теплового шока.
Мы считаем, что на этом защитная роль шаперонов и пептидов не исчерпывается. Учитывая высокое сродство шаперонов, в том числе HSP70 и HSP90, к пептидам, можно предположить, что в ближайшее время будут созданы комплексные препараты HSP70- пептиды и HSP90- пептиды, в том числе и с трансфер-фактором благодаря чему их защитное, иммуностимулирующее и геропротекторное действие значительно усилится.
Нам хочется остановиться еще на одном механизме воздействия на физиологические функции организма, осуществляемого пептидами и, в том числе, транфер-фактором. Речь пойдёт о цитокинах, которые, по образному выражению М.А. Пальцева и соавторов (2003), составляют «микроэндокринную систему». Более того, цитокины обеспечивают взаимодействие нервной, эндокринной, иммунной системы и системы гемостаза [10]. Одной из важнейших функций цитокинов является регуляция гемопоэза.
Вместе с тем, многочисленными исследованиями установлено, что большинство пептидов с молекулярной массой до 10000 Д, к коим относится и трансфер- фактор, при самых различных патологических состояниях и стрессах способствуют восстановлению нормального баланса между уровнем провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и таким образом нормализуют нервно-эндокринные взаимоотношения, функции врожденного и адаптивного иммунитета, а также гемопоэза и гемостаза [4,9]. Всё это благотворно действует на общем состоянии организма, способствуя значительному продлению сроков жизни [27].
Все представленные в этом обзоре сведения говорят о том, что у трансфер- фактора есть все основания для использования в качестве не только профилактического, но и вспомогательного терапевтического средства при самых различных патологических состояниях.
Список литературы:
1. Арьяева М.М. Трансфер фактор в комплексной терапии бронхиальной астмы средней степени тяжести// Экология. Здоровье. Спорт: Материалы II Международной научно-практической конференции.- Чита: ЧитГУ, 2010.- С.113-116.
2. Арьяева М. М., Цыбиков Н.Н. Влияние трансфер фактора на уровень аутоантител в комплексном лечении больных сахарным диабетом// Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Новосибирск, 2011.- С. 31-34.
3. Боковой А.Г. Применение трансфер факторов в лечении инфекционных заболеваний у детей и взрослых// Пятиминутка.- №2- С. 15-17.
4. Витковский Ю.А., Кузник Б.И. Влияние интерлейкина 1 на свертываемость крови и фибринолиз // Гематология и трансфузиология. – 1999. - №1. – С. 27.- 30.
5. Егорова Е.В., Цыбиков Н.Н., Пересторонин В.И., Арьяева М.М. Динамика иммуноглобулинов в сыворотке крови и назальном секрете у больных хроническим гнойным синуситом после местного применения трансфер фактора // Российская ринология. – 2011. - №2.
6. Карбышева Н.В., Карбышев И.А., Татаринцев П.Б., МакКосланд К., Оганова Э.А. Трансфер факторы в лечении больных вирусными гепатитами// Сибирский журнал: Гастроэнтерология и гепатология. – 2003. - №16.- С. 147-149.
7. Кузник Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии. Чита: Экспресс-издательство, 2010. – 828 с.
8. Кузник Б.И. Взаимосвязи иммунитета в эксперименте и клинике// IV Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии»: Москва, 2009. – С. 267 – 9.
9. Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков Н.Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. Москва: Медицина, 1989. – 326 с.
10. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований. Санкт-Петербург: Наука, 1998.- 310с.
11. Кузник Б.И., Пинелис И.С., Хавинсон В.Х. Применение петидных биорегуляторов в стоматологии. Санкт-Петербург: Эскулап, 1999.- 142 с.
12. Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветной И.М. Соотношение апоптоза и пролиферации клеток тимуса при его инволюции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – Т.151,№4. – С.442 -444.
13. Маргулис Б.А., Гущина И.В. Белки стресса // Цитология. – 2000. - №4. – С.323 -42.
14. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., В.В. Малинин. Пептидные тимомиметики. Санкт-Петербург: Наука,2003. – 157 с.
15. Новоселова Е.Г., Глушкова О.С., Черенков Д.А. и др. Продукция белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе // Биохимия. – 2006. Вып. 4. – С. 471 – 80.
16. Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. Москва: Медицина, 2003. – 288с.
17. Пшеничникова М.Г., Зеленина О.М., Круглов С.В. и др. Синтез белков теплового шока (HSP) в лейкоцитах крови как показатель устойчивости к стрессорным повреждениям // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – №12. - С. 614 -7.
18. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В. Свободнорадикальное окисление и старение. Санкт-Петербург: Наука, 2003. – 327 с.
19. Хаитов Р. М. Иммунология и аллергология. Москва: Медицина, 2000. – 384с.
20. Цыбиков Н.Н. Материалы по взаимосвязи иммуногенеза и гемостаза в эксперименте: Автореферат дисс. ... доктора медицинских наук, Ленинград, 1983. – 42с.
21. Krivosheeva E. M., Aryaeva M. M. Study of nootropic activity spectrum of Transfer factor Plus//Current advances in Microbiology, Immunology and Allergology: Second International Conference. – Ulaanbator, Mongolia, 2010. – P. 28.
22. Kuznik B. I., Tsibikov N.N. Cytokines, Immuniglobulins and Hemostasis // Hematol.Rev. – 1996. – V. 7., Part 2, - P. 43 -70.
23. Pockley A. G. Heat shock proteins as regulation of the immune respose // Lancet. – V. 362. – P. 469 – 76.
24. Phenotypic expression of autoimmune autistic disorder (AAD): A mayor subset of autism. Vijendra K. Singh // Annals of clinical psychiatry, 2009, 21 (3): 148 – 161.
25. Ritossa F.A. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila// Experientia. – 1962. – 1962. – V. 18. – P. 571 -3.
26. Tsybikov N.N., Kuznik B.I. Immune mechanisms of the Sistem Regulating the Aggregate State of Blood. New York, 1998. – 66 p.
27. V. Kh. Khavinson, V.V. Malinin. Gerontological Aspects of Genome Peptide Regulation. Basel.: Karger, 2005. – 104 p.